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Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonien, Spanien * Diese Autoren haben gleich einige Einblicke in diese Arbeit Hintergrund des Beitrags: Hyaluronsäure (HA) ist ein natürlich vorkommendes Polysaccharid, das bei der Herstellung von Hautfüllern für ästhetische Zwecke verwendet wird.Da es in menschlichem Gewebe eine Halbwertszeit von mehreren Tagen hat, werden Hautfüller auf HA-Basis chemisch modifiziert, um ihre Lebensdauer im Körper zu verlängern.Die häufigste Modifikation in kommerziellen Füllstoffen auf HA-Basis ist die Verwendung von 1,4-Butandioldiglycidylether (BDDE) als Vernetzungsmittel zum Vernetzen der HA-Ketten.Restliches oder nicht umgesetztes BDDE gilt als nicht toxisch bei <2 Teilen pro Million (ppm);Daher muss das restliche BDDE im endgültigen Hautfüller quantifiziert werden, um die Patientensicherheit zu gewährleisten.Materialien und Methoden: Diese Studie beschreibt den Nachweis und die Charakterisierung eines Nebenprodukts der Vernetzungsreaktion zwischen BDDE und HA unter alkalischen Bedingungen durch die Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS).Ergebnisse: Nach verschiedenen Analysen wurde festgestellt, dass die zur Desinfektion des HA-BDDE-Hydrogels verwendeten alkalischen Bedingungen und hohen Temperaturen die Bildung dieses neuen Nebenprodukts, der „Propylenglykol-ähnlichen“ Verbindung, förderten.Die LC-MS-Analyse bestätigte, dass das Nebenprodukt die gleiche monoisotopische Masse wie BDDE, eine andere Retentionszeit (tR) und einen anderen UV-Absorptionsmodus (λ = 200 nm) hat.Im Gegensatz zu BDDE wurde in der LC-MS-Analyse beobachtet, dass dieses Nebenprodukt unter gleichen Messbedingungen eine höhere Nachweisrate bei 200 nm aufweist.Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse zeigen, dass es kein Epoxid in der Struktur dieser neuen Verbindung gibt.Die Diskussion ist offen, um das Risiko dieses neuen Nebenprodukts zu bewerten, das bei der Herstellung von HA-BDDE-Hydrogel (HA-Hautfüller) für kommerzielle Zwecke gefunden wird.Schlüsselwörter: Hyaluronsäure, HA-Hautfüller, vernetzte Hyaluronsäure, BDDE, LC-MS-Analyse, BDDE-Nebenprodukt.
Füllstoffe auf Basis von Hyaluronsäure (HA) sind die häufigsten und beliebtesten dermalen Füllstoffe, die für kosmetische Zwecke verwendet werden.1 Dieser Hautfüller ist ein Hydrogel, das normalerweise aus > 95 % Wasser und 0,5–3 % HA besteht, was ihm eine gelartige Struktur verleiht.2 HA ist ein Polysaccharid und der Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix von Wirbeltieren.Eine der Zutaten.Es besteht aus (1,4)-Glucuronsäure-β (1,3)-N-acetylglucosamin (GlcNAc) sich wiederholenden Disaccharideinheiten, die durch glykosidische Bindungen verbunden sind.Dieses Disaccharidmuster ist in allen Organismen gleich.Verglichen mit einigen Füllstoffen auf Proteinbasis (wie Kollagen) macht diese Eigenschaft HA zu einem hochgradig biokompatiblen Molekül.Diese Füllstoffe können eine Aminosäuresequenzspezifität aufweisen, die vom Immunsystem des Patienten erkannt werden kann.
Bei der Verwendung als Hautfüller besteht die Hauptbeschränkung von HA in seinem schnellen Umsatz innerhalb des Gewebes aufgrund des Vorhandenseins einer bestimmten Enzymfamilie namens Hyaluronidasen.Bisher wurden mehrere chemische Modifikationen in der HA-Struktur beschrieben, um die Halbwertszeit von HA in Geweben zu erhöhen.3 Die meisten dieser Modifikationen versuchen, den Zugang von Hyaluronidase zu Polysaccharidpolymeren durch Vernetzen von HA-Ketten zu verringern.Daher produziert das vernetzte HA-Hydrogel aufgrund der Bildung von Brücken und der intermolekularen kovalenten Bindungen zwischen der HA-Struktur und dem Vernetzungsmittel mehr Anti-Enzym-Abbauprodukte als das natürliche HA.4-6
Bisher umfassen die zur Herstellung von vernetztem HA verwendeten chemischen Vernetzungsmittel Methacrylamid, 7-Hydrazid, 8-Carbodiimid, 9-Divinylsulfon, 1,4-Butandioldiglycidylether (BDDE) und Poly(ethylenglykol)diglycidylether.10 ,11 BDDE ist derzeit das am häufigsten verwendete Vernetzungsmittel.Obwohl sich diese Arten von Hydrogelen seit Jahrzehnten als sicher erwiesen haben, handelt es sich bei den verwendeten Vernetzungsmitteln um reaktive Reagenzien, die zytotoxisch und in einigen Fällen mutagen sein können.12 Daher muss ihr Restgehalt im fertigen Hydrogel hoch sein.BDDE gilt als sicher, wenn die Restkonzentration weniger als 2 Teile pro Million (ppm) beträgt.4
Es gibt mehrere Methoden, um die BDDE-Konzentration, den Vernetzungsgrad und die Substitutionsposition in HA-Hydrogeln mit niedrigem Rückstand nachzuweisen, wie z Diodenarray-gekoppelte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).13-17 Diese Studie beschreibt den Nachweis und die Charakterisierung eines Nebenprodukts im endgültigen vernetzten HA-Hydrogel, das durch die Reaktion von BDDE und HA unter alkalischen Bedingungen hergestellt wird.HPLC und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS-Analyse).Da die Toxizität dieses Nebenprodukts von BDDE unbekannt ist, empfehlen wir, dass seine Rückstandsquantifizierung auf ähnliche Weise bestimmt werden sollte wie die Methode, die normalerweise für BDDE im Endprodukt durchgeführt wird.
Das erhaltene Natriumsalz von HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japan) hat ein Molekulargewicht von ~1.368.000 Da (Laurent-Verfahren) 18 und eine Grenzviskosität von 2,20 m3/kg.Für die Vernetzungsreaktion wurde BDDE (≥ 95 %) von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen.Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH 7,4 wurde von Sigma-Aldrich Company bezogen.Alle Lösungsmittel, Acetonitril und Wasser, die in der LC-MS-Analyse verwendet wurden, wurden von HPLC-Qualität gekauft.Ameisensäure (98 %) wird in Reagenzqualität gekauft.
Alle Experimente wurden auf einem UPLC Acquity-System (Waters, Milford, MA, USA) durchgeführt und mit einem API 3000-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer verbunden, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle ausgestattet war (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Die Synthese von vernetzten HA-Hydrogeln wurde durch Zugabe von 198 mg BDDE zu einer 10 % (w/w) Natriumhyaluronat (NaHA)-Lösung in Gegenwart von 1 % Alkali (Natriumhydroxid, NaOH) gestartet.Die BDDE-Endkonzentration im Reaktionsgemisch betrug 9,9 mg/ml (0,049 mM).Dann wurde die Reaktionsmischung gründlich gemischt und homogenisiert und 4 Stunden lang bei 45°C fortschreiten gelassen.19 Der pH-Wert der Reaktion wird bei ~12 gehalten.
Danach wurde die Reaktionsmischung mit Wasser gewaschen und das fertige HA-BDDE-Hydrogel wurde filtriert und mit PBS-Puffer verdünnt, um eine HA-Konzentration von 10 bis 25 mg/ml und einen End-pH-Wert von 7,4 zu erreichen.Um die hergestellten vernetzten HA-Hydrogele zu sterilisieren, werden alle diese Hydrogele autoklaviert (120°C für 20 Minuten).Das gereinigte BDDE-HA-Hydrogel wird bis zur Analyse bei 4°C gelagert.
Um das in dem vernetzten HA-Produkt vorhandene BDDE zu analysieren, wurde eine 240-mg-Probe gewogen und in das Mittelloch eingeführt (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; Volumen 0,5 ml) und bei 10.000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert 10 Minuten.Insgesamt wurden 20 ul Pulldown-Flüssigkeit gesammelt und analysiert.
Um den BDDE-Standard (Sigma-Aldrich Co) unter alkalischen Bedingungen (1 %, 0,1 % und 0,01 % NaOH) zu analysieren, ist die flüssige Probe 1:10, 1:100 oder bis zu 1:10, 1:100, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind 1:1.000.000 Verwenden Sie bei Bedarf entionisiertes MilliQ-Wasser für die Analyse.
Für die in der Vernetzungsreaktion verwendeten Ausgangsmaterialien (HA 2 %, H 2 O, 1 % NaOH und 0,049 mM BDDE) wurde 1 ml jeder aus diesen Materialien hergestellten Probe unter Verwendung der gleichen Analysebedingungen analysiert.
Um die Spezifität der in der Ionenkarte erscheinenden Peaks zu bestimmen, wurden 10 &mgr;l 100 ppb BDDE-Standardlösung (Sigma-Aldrich Co.) zu der 20 &mgr;l-Probe hinzugefügt.In diesem Fall beträgt die Endkonzentration des Standards in jeder Probe 37 ppb.
Bereiten Sie zunächst eine BDDE-Stammlösung mit einer Konzentration von 11.000 mg/L (11.000 ppm) vor, indem Sie 10 l Standard-BDDE (Sigma-Aldrich Co) mit 990 l MilliQ-Wasser (Dichte 1,1 g/ml) verdünnen.Verwenden Sie diese Lösung, um eine 110 µg/l (110 ppb) BDDE-Lösung als Zwischenstandardverdünnung herzustellen.Verwenden Sie dann das BDDE-Zwischenverdünnungsmittel (110 ppb), um die Standardkurve zu erstellen, indem Sie das Zwischenverdünnungsmittel mehrmals verdünnen, um die gewünschte Konzentration von 75, 50, 25, 10 und 1 ppb zu erreichen.Wie in Abbildung 1 gezeigt, zeigt sich, dass die BDDE-Standardkurve von 1,1 bis 110 ppb eine gute Linearität aufweist (R2 > 0,99).Die Standardkurve wurde in vier unabhängigen Experimenten wiederholt.
Abbildung 1 Durch LC-MS-Analyse erhaltene BDDE-Standardkalibrierungskurve, in der eine gute Korrelation beobachtet wird (R2>0,99).
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie.
Um die in der vernetzten HA vorhandenen BDDE-Standards und die BDDE-Standards in der Basislösung zu identifizieren und zu quantifizieren, wurde eine LC-MS-Analyse verwendet.
Die chromatographische Trennung wurde auf einer LUNA 2,5 µm C18(2)-HST-Säule (50 × 2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) erreicht und während der Analyse bei Raumtemperatur (25 °C) gehalten.Die mobile Phase besteht aus Acetonitril (Lösungsmittel A) und Wasser (Lösungsmittel B) mit 0,1 % Ameisensäure.Die mobile Phase wird durch Gradientenelution eluiert.Der Gradient ist wie folgt: 0 Minuten, 2 % A;1 Minute, 2 % A;6 Minuten, 98 % A;7 Minuten, 98 % A;7,1 Minuten, 2 % A;10 Minuten, 2 % A. Die Laufzeit beträgt 10 Minuten und das Injektionsvolumen 20 µL.Die Retentionszeit von BDDE beträgt etwa 3,48 Minuten (im Bereich von 3,43 bis 4,14 Minuten, basierend auf Experimenten).Die mobile Phase wurde für die LC-MS-Analyse mit einer Flussrate von 0,25 ml/min gepumpt.
Für die BDDE-Analyse und -Quantifizierung durch MS wird das UPLC-System (Waters) mit einem API 3000-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (AB SCIEX) kombiniert, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle ausgestattet ist, und die Analyse wird im positiven Ionenmodus (ESI+) durchgeführt.
Gemäß der an BDDE durchgeführten Ionenfragmentanalyse wurde das Fragment mit der höchsten Intensität als das Fragment bestimmt, das 129,1 Da entspricht (Fig. 6).Daher beträgt im Multi-Ionen-Überwachungsmodus (MIM) zur Quantifizierung die Massenumwandlung (Masse-zu-Ladung-Verhältnis [m/z]) von BDDE 203,3/129,1 Da.Es verwendet auch den Full-Scan-Modus (FS) und den Product-Ion-Scan-Modus (PIS) für die LC-MS-Analyse.
Um die Spezifität des Verfahrens zu verifizieren, wurde eine Blindprobe (anfängliche mobile Phase) analysiert.In der Blindprobe mit einer Massenumrechnung von 203,3/129,1 Da wurde kein Signal detektiert.Hinsichtlich der Wiederholbarkeit des Experiments wurden 10 Standardinjektionen von 55 ppb (in der Mitte der Kalibrierungskurve) analysiert, was zu einer Reststandardabweichung (RSD) < 5 % führte (Daten nicht gezeigt).
Der Rest-BDDE-Gehalt wurde in acht verschiedenen autoklavierten BDDE-vernetzten HA-Hydrogeln quantifiziert, was vier unabhängigen Experimenten entspricht.Wie im Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben, wird die Quantifizierung durch den Mittelwert der Regressionskurve der BDDE-Standardverdünnung bewertet, der dem eindeutigen Peak entspricht, der beim BDDE-Massenübergang von 203,3/129,1 Da nachgewiesen wurde, mit einer Retention Zeit von 3.43 bis 4.14 Minuten Nicht warten.Abbildung 2 zeigt ein Beispielchromatogramm des 10-ppb-BDDE-Referenzstandards.Tabelle 1 fasst den BDDE-Restgehalt von acht verschiedenen Hydrogelen zusammen.Der Wertebereich liegt zwischen 1 und 2,46 ppb.Daher ist die BDDE-Restkonzentration in der Probe für den menschlichen Gebrauch akzeptabel (< 2 ppm).
Abbildung 2 Ionenchromatogramm von 10 ppb BDDE-Referenzstandard (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z)-Übergang, erhalten durch LC-MS-Analyse von 203,30/129,10 Da (im positiven MRM-Modus).
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen;MS, Masse;m/z, Masse-zu-Ladung-Verhältnis.
Hinweis: Die Proben 1–8 sind autoklavierte BDDE-vernetzte HA-Hydrogele.Die Restmenge an BDDE im Hydrogel und der Peak der BDDE-Retentionszeit werden ebenfalls angegeben.Schließlich wird auch über die Existenz neuer Peaks mit unterschiedlichen Retentionszeiten berichtet.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;HA, Hyaluronsäure;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen;tR, Retentionszeit;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;RRT, relative Retentionszeit.
Überraschenderweise zeigte die Analyse des LC-MS-Ionenchromatogramms, dass basierend auf allen analysierten Proben von autoklaviertem vernetztem HA-Hydrogel ein zusätzlicher Peak bei der kürzeren Retentionszeit von 2,73 bis 3,29 Minuten vorhanden war.Abbildung 3 zeigt beispielsweise das Ionenchromatogramm einer Probe von vernetztem HA, bei der ein zusätzlicher Peak bei einer anderen Retentionszeit von etwa 2,71 Minuten auftritt.Die beobachtete relative Retentionszeit (RRT) zwischen dem neu beobachteten Peak und dem Peak von BDDE betrug 0,79 (Tabelle 1).Da wir wissen, dass der neu beobachtete Peak in der C18-Säule, die in der LC-MS-Analyse verwendet wird, weniger zurückgehalten wird, kann der neue Peak einer polareren Verbindung als BDDE entsprechen.
Abbildung 3 Ionenchromatogramm einer Probe aus vernetztem HA-Hydrogel, erhalten durch LC-MS (MRM-Massenumwandlung 203,3/129,0 Da).
Abkürzungen: HA, Hyaluronsäure;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen;RRT, relative Retentionszeit;tR, Retentionszeit.
Um auszuschließen, dass es sich bei den beobachteten neuen Peaks um ursprünglich in den eingesetzten Rohstoffen vorhandene Verunreinigungen handeln könnte, wurden auch diese Rohstoffe mit der gleichen LC-MS-Analysemethode analysiert.Die analysierten Ausgangsmaterialien umfassen Wasser, 2 % NaHA in Wasser, 1 % NaOH in Wasser und BDDE in der gleichen Konzentration, die in der Vernetzungsreaktion verwendet wurde.Das Ionenchromatogramm des verwendeten Ausgangsmaterials zeigte keine Verbindung oder keinen Peak, und seine Retentionszeit entspricht dem neu beobachteten Peak.Diese Tatsache verwirft die Vorstellung, dass nicht nur das Ausgangsmaterial irgendwelche Verbindungen oder Substanzen enthalten könnte, die das Analyseverfahren stören könnten, sondern es gibt auch keine Anzeichen für eine mögliche Kreuzkontamination mit anderen Laborprodukten.Die nach LC-MS-Analyse von BDDE und neuen Peaks erhaltenen Konzentrationswerte sind in Tabelle 2 (Proben 1-4) und das Ionenchromatogramm in Abbildung 4 dargestellt.
Hinweis: Die Proben 1–4 entsprechen den Rohmaterialien, die zur Herstellung von autoklavierten BDDE-vernetzten HA-Hydrogelen verwendet wurden.Diese Proben wurden nicht autoklaviert.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;HA, Hyaluronsäure;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen.
4 entspricht dem LC-MS-Chromatogramm einer Probe des Ausgangsmaterials, das in der Vernetzungsreaktion von HA und BDDE verwendet wurde.
Hinweis: All dies wird bei der gleichen Konzentration und dem gleichen Verhältnis gemessen, das zur Durchführung der Vernetzungsreaktion verwendet wird.Die Zahlen für die durch das Chromatogramm analysierten Rohmaterialien entsprechen: (1) Wasser, (2) 2% wässrige HA-Lösung, (3) 1% wässrige NaOH-Lösung.Die LC-MS-Analyse wird für die Massenumwandlung von 203,30/129,10 Da (im positiven MRM-Modus) durchgeführt.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;HA, Hyaluronsäure;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen.
Die Bedingungen, die zur Bildung neuer Peaks führten, wurden untersucht.Um zu untersuchen, wie die zur Herstellung des vernetzten HA-Hydrogels verwendeten Reaktionsbedingungen die Reaktivität des BDDE-Vernetzungsmittels beeinflussen, was zur Bildung neuer Peaks (mögliche Nebenprodukte) führt, wurden verschiedene Messungen durchgeführt.Bei diesen Bestimmungen untersuchten und analysierten wir den endgültigen BDDE-Vernetzer, der mit verschiedenen Konzentrationen von NaOH (0 %, 1 %, 0,1 % und 0,01 %) in einem wässrigen Medium behandelt wurde, gefolgt von oder ohne Autoklavieren.Das Bakterienverfahren zur Simulation der gleichen Bedingungen ist das gleiche wie das zur Herstellung des vernetzten HA-Hydrogels verwendete Verfahren.Wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben, wurde der Massenübergang der Probe durch LC-MS auf 203,30/129,10 Da analysiert.Der BDDE und die Konzentration des neuen Peaks werden berechnet und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. In den Proben, die nicht autoklaviert wurden, wurden keine neuen Peaks nachgewiesen, unabhängig von der Anwesenheit von NaOH in der Lösung (Proben 1–4, Tabelle 3). 3).Bei autoklavierten Proben werden neue Peaks nur in Gegenwart von NaOH in der Lösung nachgewiesen, und die Bildung des Peaks scheint von der NaOH-Konzentration in der Lösung abzuhängen (Proben 5–8, Tabelle 3) (RRT = 0,79).Abbildung 5 zeigt ein Beispiel eines Ionenchromatogramms, das zwei autoklavierte Proben in Gegenwart oder Abwesenheit von NaOH zeigt.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen.
Hinweis: Das obere Chromatogramm: Die Probe wurde mit 0,1 % wässriger NaOH-Lösung behandelt und autoklaviert (120 °C für 20 Minuten).Unteres Chromatogramm: Die Probe wurde nicht mit NaOH behandelt, sondern unter den gleichen Bedingungen autoklaviert.Die Massenumwandlung von 203,30/129,10 Da (im positiven MRM-Modus) wurde durch LC-MS analysiert.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen.
In allen autoklavierten Proben, mit oder ohne NaOH, war die BDDE-Konzentration stark reduziert (bis zum 16,6-fachen) (Proben 5-8, Tabelle 2).Die Abnahme der BDDE-Konzentration kann darauf zurückzuführen sein, dass Wasser bei hohen Temperaturen als Base (Nucleophil) wirken kann, um den Epoxidring von BDDE zu öffnen, um eine 1,2-Diol-Verbindung zu bilden.Die monoisotopische Qualität dieser Verbindung unterscheidet sich von der von BDDE und wird daher nicht beeinträchtigt.LC-MS detektierte eine Massenverschiebung von 203,30/129,10 Da.
Schließlich zeigen diese Experimente, dass die Erzeugung neuer Peaks von der Anwesenheit von BDDE, NAOH und dem Autoklavierprozess abhängt, aber nichts mit HA zu tun hat.
Der bei einer Retentionszeit von ungefähr 2,71 Minuten gefundene neue Peak wurde dann durch LC-MS charakterisiert.Zu diesem Zweck wurde BDDE (9,9 mg/ml) in einer 1%igen wässrigen NaOH-Lösung inkubiert und autoklaviert.In Tabelle 4 werden die Eigenschaften des neuen Peaks mit dem bekannten BDDE-Referenzpeak (Retentionszeit etwa 3,47 Minuten) verglichen.Basierend auf der Ionenfragmentierungsanalyse der beiden Peaks kann geschlossen werden, dass der Peak mit einer Retentionszeit von 2,72 Minuten die gleichen Fragmente wie der BDDE-Peak zeigt, jedoch mit unterschiedlichen Intensitäten (Abbildung 6).Für den Peak, der der Retentionszeit (PIS) von 2,72 Minuten entspricht, wurde ein intensiverer Peak nach Fragmentierung bei einer Masse von 147 Da beobachtet.Bei der bei dieser Bestimmung verwendeten BDDE-Konzentration (9,9 mg/ml) wurden nach chromatographischer Trennung auch unterschiedliche Absorptionsmodi (UV, λ = 200 nm) im UV-Spektrum beobachtet (Abbildung 7).Der Peak mit einer Retentionszeit von 2,71 Minuten ist noch bei 200 nm sichtbar, während der BDDE-Peak unter den gleichen Bedingungen im Chromatogramm nicht zu erkennen ist.
Tabelle 4 Charakterisierungsergebnisse des neuen Peaks mit einer Retentionszeit von etwa 2,71 Minuten und des BDDE-Peaks mit einer Retentionszeit von 3,47 Minuten
Hinweis: Um diese Ergebnisse zu erhalten, wurden LC-MS- und HPLC-Analysen (MRM und PIS) an den beiden Peaks durchgeführt.Für die HPLC-Analyse wird eine UV-Detektion mit einer Wellenlänge von 200 nm verwendet.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;HPLC, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen;m/z, Masse-zu-Ladung-Verhältnis;PIS, Produkt-Ionen-Scanning;ultraviolettes Licht, ultraviolettes Licht.
Hinweis: Die Massenfragmente werden durch LC-MS-Analyse (PIS) erhalten.Oberes Chromatogramm: Massenspektrum von BDDE-Standard-Probenfragmenten.Unteres Chromatogramm: Das Massenspektrum des neu erkannten Peaks (RRT, das dem BDDE-Peak zugeordnet ist, beträgt 0,79).BDDE wurde in 1%iger NaOH-Lösung verarbeitet und autoklaviert.
Abkürzungen: BDDE, 1,4-Butandioldiglycidylether;LC-MS, Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie;MRM, Überwachung mehrerer Reaktionen;PIS, Produktions-Ionen-Scan;RRT, relative Retentionszeit.
Abbildung 7 Ionenchromatogramm des 203,30 Da-Vorläuferions und (A) der neue Peak mit einer Retentionszeit von 2,71 Minuten und (B) die UV-Detektion des BDDE-Referenzstandardpeaks bei 3,46 Minuten bei 200 nm.
Bei allen hergestellten vernetzten HA-Hydrogeln wurde beobachtet, dass die BDDE-Restkonzentration nach LC-MS-Quantifizierung < 2 ppm war, aber ein neuer unbekannter Peak in der Analyse auftauchte.Dieser neue Peak entspricht nicht dem BDDE-Standardprodukt.Auch das BDDE-Standardprodukt wurde im positiven MRM-Modus der gleichen Qualitätsumwandlung (MRM-Umwandlung 203,30/129,10 Da) unterzogen.Im Allgemeinen werden andere Analysemethoden wie Chromatographie als Grenztests zum Nachweis von BDDE in Hydrogelen verwendet, aber die maximale Nachweisgrenze (LOD) liegt etwas unter 2 ppm.Andererseits wurden bisher NMR und MS verwendet, um den Grad der Vernetzung und/oder Modifikation von HA in den Zuckereinheitsfragmenten von vernetzten HA-Produkten zu charakterisieren.Der Zweck dieser Techniken war nie die Quantifizierung des Rest-BDDE-Nachweises bei so niedrigen Konzentrationen, wie wir sie in diesem Artikel beschreiben (LOD unserer LC-MS-Methode = 10 ppb).
Postzeit: 01.09.2021